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禽流感病毒H5亞型RT-PCR檢測試劑盒

禽流感病毒H5亞型RT-PCR檢測試劑盒
【產品名稱】
     通用名稱:禽流感病毒H5亞型RT-PCR檢測試劑盒
     英文名稱:Diagnostic Kit for Avian Influenza Virus H5 Genotype (RT-PCR)
【預期用途】
禽流感病毒H5亞型屬于高致病性禽流感,對禽類危害巨大,甚至會感染人群。本試劑盒用于定性檢測具流感癥狀的人群或禽類動物的唾液或分泌物及組織中的H5亞型禽流感病毒,適用于對該亞型病毒的檢測、臨床輔助診斷和流行病學調查。

 

【檢測原理】
本試劑盒采用柱式法提取樣品RNA,并針對禽流感病毒H5亞型血球凝集素基因的高度保守序列,設計特異性引物,通過一步法RT-PCR反轉擴增靶序列,使目的基因擴大百萬倍,經瓊脂糖凝膠電泳,在紫外光下對條帶觀察判定,實現對H5亞型禽流感病毒的快速檢測。
【試劑盒組份】
     1、試劑盒組成及貯藏條件
名稱 20份 貯藏條件
1、0.2 mL PCR管 25個 冷藏
(A盒)
2、吸附柱 20個
3、收集管 20個
4、裂解液 10 ml
5、洗液 2*10ml
6、洗脫液 500μL
7、TAE緩沖液(50×) 20ml
8、陽性對照 50μL -20℃
(B盒)
9、陰性對照 50μL
10、RT-PCR反應液A 120μL
11、RT-PCR反應液B 240μL
    2、有效期:6個月。
    3、需自備材料:生理鹽水、組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、無菌注射器、無RNA酶1.5ml EP管和吸頭、瓊脂糖、DL2000、染色液。
【操作步驟】
    一、樣品制備
1、拭子樣品:用棉拭子沾取禽類動物呼吸道分泌物或排泄物等,置于生理鹽水中攪拌,低溫保存送檢;
2、組織樣品:采集有明顯病變的組織樣品1.0g,眼科剪剪碎于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨,再加少量生理鹽水混勻,4℃條件下8000rpm,離心1min,取上清于滅菌的離心管中待檢。
    3、樣本要求:采樣量要足夠進行一次復檢,運輸、儲存過程確保低溫,盡量避免反復凍融,檢測前需充分解凍。
    二、病毒RNA的提取
    1、向無RNA酶的1.5ml EP管中分別加入樣品液200μL、裂解液 500μL,顛倒混勻,靜置2~3min;
    2、將液體轉入套有收集管的吸附柱中(取上清液避免堵塞柱子),12000rpm離心1min;
    3、棄收集管液體,向吸附柱中加500μL洗液,12000rpm離心1min;
    4、重復步驟3;
    5、棄收集管液體,瞬離以徹底去除殘留液體;
    6、吸附柱轉入新的無酶EP管中,柱中央滴加20μL洗脫液,室溫靜置2min,12000rpm離心1min,EP管中液體即為RNA溶液;
    三、RT-PCR
    1、配液:取出RT-PCR反應液,在室溫融化后,瞬離,按照每份RT-PCR反應液A液5μL,RT-PCR反應液B液10μL的比例預混兩種反應液,按15μL /管分裝到PCR反應管中;
    2、加樣擴增:分別向PCR管中加入5μL樣本RNA或陰性對照或陽性對照,在PCR儀上運行以下程序:42℃ 30 min,94℃ 3 min;94℃ 15 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,35個循環;72℃ 7 min。
    四、電泳鑒定
    1、制膠:用50倍TAE電泳緩沖液稀釋到1倍后配制適量1.0%瓊脂糖凝膠;
    2、電泳:直接取5μL~10μL RT-PCR產物或DL2000直接點樣于凝膠孔中,以5 V/cm電壓于1倍TAE電泳緩沖液中電泳;
    3、染色、觀察:將電泳好的凝膠放在加有染色液的1倍TAE緩沖液中浸泡數分鐘,取出(小心污染)在紫外燈下觀察結果,進行判定并做好檢測記錄。
【結果判定】
1、成立條件:陽性對照出現380 bp條帶,陰性對照無目的帶時,試驗結果成立。
2、結果判定:被檢樣品出現380 bp條帶為H5亞型禽流感病毒陽性;否則判定為陰性。
【注意事項】
    1、實驗前請仔細閱讀本試劑盒說明書,嚴格按操作步驟執行;不使用本試劑盒提供的組分或不按照說明書進行實驗將可能導致錯誤結果。
    2、實驗室管理應嚴格按照國家有關臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。實驗人員須為專業人員,實驗過程應分區進行,每個階段使用專用的儀器和設備;各區間人員流動及空氣流向應有嚴格要求;實驗用消耗品應有合理的清潔和質檢程序,避免環境或物品污染PCR殘留產物導致假陽性結果,避免核酸酶污染或擴增反應抑制物造成假陰性結果。
    3、所有病料相關容器應盡量潔凈、無菌、低溫條件保存;完成樣本核酸提取后,建議馬上進行下一步試驗,短期可保存于-20℃,長期應保存在-70℃。
    4、操作臺、移液器、離心機、耗材等儀器用品應經常用1.0%次氯酸鈉或稀鹽酸擦拭消毒或浸泡。實驗房間、超凈工作臺應定期或每次實驗后用紫外燈處理。
    5、所有試劑應在規定的溫度儲存,-20℃保存的各種試劑使用前應于室溫下完全融化,使用后立即放回-20℃。
    6、染色液有毒,應于室溫下避光保存,操作時應戴上手套,相應操作結束后手套要處理掉,不能再接觸其它任何物品,以減少污染區。
    7、注意防止試劑盒組分受污染。試劑盒間成分勿混用,吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
    8、實驗產生的廢棄物等應及時收集,遠離PCR實驗室才能進行無害化處理。

 


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